莓實假單胞菌的全基因組測序及分析（二）

2 結果與分析

2.1 基因組特征分析

莓實假單胞菌NMC25基因組完成圖信息公布在GenBank中，登錄號為NZ_CP021132.1。?NMC25基因組組裝為4 個Scaffold，包含1 個染色體和3 個質粒，測得的總基因組大小為5.152 13 Mb，GC含量為59.21%。菌株基因組中包含4 725 個基因（染色體4 571 個，質粒154 個），編碼區基因4 494 個（染色體4 366 個，質粒128 個），結構RNA 97 個（rRNA 25 個，tRNA 72 個）。

2.2 基因組功能注釋

2.2.1 COG注釋分析

COG是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫，將測定的序列與數據庫進行比對預測這些蛋白可能的功能并對其做功能分類統計。由圖1可知，在基因組的直系蛋白聚類分析中，除R（一般功能預測）蛋白之外，數量最多的是E（氨基酸轉運與代謝）相關蛋白，數量超過了500 個；其次是T（信號轉導機制）、P（無機離子轉運與代謝）和K（轉錄相關蛋白），數量均超過了400 個；與氨基酸相比，碳水化合物和脂質轉運代謝相關蛋白數量較少，均不超過200 個。

圖 1 莓實假單胞菌NMC25基因組的COG功能分類

2.2.2 GO注釋分析

使用BLAST2 GO軟件得到NMC25 基因組的GO功能注釋結果，選取基因數量最多的10 個GO功能分類見表1。GO總共有3 個大類，分別描述基因參與的生物學過程、分子功能和細胞成分。在生物學過程分類中，參與代謝過程的基因數量最多，為1 921 個；在細胞成分分類中，與膜相關的基因數量最多，為679 個；在分子功能分類中則是催化活性基因數量最多，為1 899 個。整體來看，能夠參與細菌代謝過程和催化反應的基因數量最多。

表 1 莓實假單胞菌NMC25基因組的GO功能分類

2.2.3 KEGG注釋分析

KEGG是系統分析基因產物在細胞中代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫，利用KEGG 可以進一步研究基因在生物學上的復雜行為。在NMC25基因組中共有1 474 個基因注釋到了KEGG通路中，從中選取數量最多的10 個通路展示，如表2所示。其中，富集到ABC轉運蛋白、雙組分系統、氨基酸合成和碳代謝通路的基因數量最多，分別為183、171、127 個和111 個。ABC轉運蛋白廣泛存在于微生物體內，在離子、單糖、氨基酸、磷脂、肽、多糖及蛋白質等營養攝取的過程中扮演了重要的角色；而雙組分系統可以調控氨基酸代謝和介導假單胞菌對外界環境的應激響應。此外，參與鞭毛組裝、細菌分泌系統和氧化磷酸化相關通路的基因數量也較多。

表 2 莓實假單胞菌NMC25基因組的KEGG注釋

2.2.4 CAZy注釋分析

CAZy數據庫包括能催化碳水化合物降解、修飾以及生物合成的碳水化合物相關酶系家族。注釋結果顯示，在NMC25基因組中包含大量糖基轉移酶和糖苷水解酶，分別為1 528 個和1 324 個（圖2）。糖基轉移酶能夠催化活化的糖連接到不同受體分子上，例如參與細菌胞外多糖的生物合成[23]；糖苷水解酶作為糖類代謝的關鍵組分，能夠催化各種糖基化合物中糖苷鍵的水解。除此之外，糖基轉移酶和糖苷酶還與受體分子的糖基化有關。而糖基化在膜蛋白介導的細胞保護、穩定及屏障等方面起到重要作用，有助于NMC25應對外界的環境應激。

圖 2 莓實假單胞菌NMC25基因組的CAZy分類

2.3 共線性分析

一般來說，如果兩個物種之間的親緣關系很近，那么基因的序列和順序都會非常接近，這種現象稱為共線性現象。共線性主要反映基因組間的結構性變異，反映出基因組之間的編碼順序和結構的同源性。從實驗可以看出，NMC25菌株與KT2440、F113和PAO1相比，基因組更小且存在共線性的序列比例均小于50%；對于另外兩株莓實假單胞菌，雖然在基因組內部存在顛換現象，3 株莓實假單胞菌的基因組更為相似，其中NMC25菌株與NRRL B-727菌株有共線性的序列達到了90%以上，但與P121菌株的共線性不足70%。

2.4 進化分析

使用不同菌株之間的單拷貝同源基因繪制進化樹。由此可以看出，NMC25與NRRL B-727菌株的進化關系最近，其次是P121。而在其他3 種假單胞菌中，與F113的進化關系最近，與PAO1最遠。同時驗證各分支的可信度百分比，發現銅綠假單胞菌PAO1與其他5 株假單胞菌差異較大。對6 株假單胞菌的進化分析結果與共線性分析的結果一致。

3 討論與結論

假單胞菌屬內有多個種，廣泛存在于土壤、水及各種植物體中。其屬內菌種表現出了豐富的代謝多樣性和廣泛的定殖環境。目前對冷鮮肉腐敗菌的研究已逐漸深入到基因水平，本團隊在前期利用宏基因組測序測定了托盤包裝下冷鮮雞肉的菌落組成多樣性，發現其中豐度最高的是莓實假單胞菌，其次是熒光假單胞菌。然而假單胞菌屬中不同種、不同分離株之間的腐敗能力會存在較大差異。莓實假單胞菌的優勢腐敗菌地位與其基因組結構組成密切相關，要對其致腐過程有深入了解需要全面明確其基因組信息。但由于目前已公布基因組完成圖的莓實假單胞菌僅有1 株，且菌株來源為極地環境，不一定能準確反映具有強致腐能力的肉源性莓實假單胞菌分離株的基因組特征，因此對分離到的肉源性強致腐菌株NMC25進行了全基因組完成圖測序。隨后為探究造成這些菌株腐敗能力差異的原因，選擇已公布序列的銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌代表菌株以及另外兩株莓實假單胞菌分離株進行了初步的比較基因組的分析。

由微生物引起的腐敗現象主要包括變色、異味和產黏，這些腐敗特征主要取決于微生物對肉中各種基質的利用情況。全基因組測序結果發現NMC25基因組中有大量氨基酸轉運代謝相關基因，表明該菌可能較多地參與氨基酸轉運代謝，因此肉類等高蛋白食品可作為其適宜的生長基質。研究表明，肉中的優勢腐敗菌可產生揮發性化合物導致異味的出現。在細菌代謝產生的揮發性化合物中，醇類、醛類和硫化物等物質均與氨基酸代謝有關。

綜合上述結果，莓實假單胞菌NMC25分離株作為1 株具有較強致腐能力的菌株，其基因組中也包含大量可能導致食品尤其是肉品腐敗的功能基因與代謝通路。本研究從基因水平上證明了該分離株具有較強的致腐潛力，對后續研究深入挖掘莓實假單胞菌的代謝特征，明確其致腐機制具有重要的意義。

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