檢測單核細胞增生李斯特氏菌的新型滾環擴增方法（二）

2 結果與分析

2.1 熒光可視化法觀察SRCA擴增產物

SRCA反應結束后，向反應管中加入1 μL的熒光染料SYBR Green I，結果如圖2所示。添加了單核細胞增生李斯特氏菌的陽性反應管1顏色由橙色變為綠色，而陰性對照2仍為橙色。

圖 2 SRCA熒光可視化結果

2.2 SRCA擴增產物測序和酶切結果分析

如圖3A所示，SRCA擴增產物經過Dra I限制性內切酶切消化后，其酶切片段為109 bp左右，與理論計算值一致。為了進一步驗證SRCA產物，對圖3A中的擴增產物電泳條帶（1～4）進行測序分析。測序結果如圖3B所示，發現SRCA的反應產物含有多個重復的特異性靶序列，且隨著靶序列拷貝數目增加，產物片段長度隨之增加。利用兩條具有特異性的引物，通過SRCA反應可以特異性的擴增目的片段，因此，可以驗證本研究中建立的SRCA方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌原理的正確性。

圖 3 單核細胞增生李斯特氏菌SRCA反應的酶切和測序結果分析

2.3 SRCA方法的特異性

本研究針對52 株菌株進行特異性分析，檢測結果如圖4所示。其中，12 株單核細胞增生李斯特氏菌發生了SRCA反應，而其他40 株非單核細胞增生李斯特氏菌均未發生SRCA反應。說明該引物具有良好的特異性。SRCA檢測方法的特異性取決于引物的設計和篩選，需要從設計出的大量引物中通過大量實驗篩選出一對合適的引物，這也是本研究的難點。

2.4 單核細胞增生李斯特氏菌純培養的靈敏度

以1.3.7節中提取的基因組DNA作為模板進行SRCA反應，向得到的反應產物中添加1 μL熒光染料SYBRGreen ?。如圖4A所示，在模板DNA質量濃度范圍為8.9×107～8.9×100 fg/μL時，反應管中出現綠色，質量濃度小于8.9×100 fg/μL時仍然為橙色，因此，SRCA熒光可視法基因組靈敏度為8.9×100 fg/μL。用相同的模板進行PCR，得到的反應產物進行凝膠電泳。如圖4B所示，在模板DNA質量濃度范圍為8.9×107～8.9×103 fg/μL時，出現了陽性擴增條帶，因此，PCR方法檢測單核細胞增生李斯特氏菌基因組的靈敏度為8.9×103 fg/μL。由此可知，SRCA方法檢測的靈敏度是PCR方法檢測靈敏度的1 000 倍。

圖 4 SRCA方法（A）和PCR方法（B）檢測的靈敏度

2.5 人工污染涼拌菜單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限

利用SRCA和PCR方法對單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株污染的涼拌菜進行檢測，結果如圖6所示。反映了SRCA方法的檢測結果，當人工污染的涼拌菜中菌濃測度為2.8×108～2.8×100 CFU/g時，反應管中出現綠色，當濃度為2.8×10－1 CFU/g時反應管中的顏色依然為橙色。因此，SRCA熒光可視法檢出限為2.8×100 CFU/g。

實驗結果反映了PCR方法檢測的結果，當人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108～2.8×103 CFU/g時，出現了陽性擴增條帶，菌濃度小于2.8×103 CFU/g時未出現擴增條帶，因此，PCR方法檢測人工污染涼拌菜中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限為2.8×103 CFU/g。由此可知，SRCA方法的檢出限是傳統PCR方法檢出限的1/1 000。

2.6 實際樣品的檢測與SRCA方法的評估

表 3 SRCA方法評價

注：—.無數據。

利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三種方法對70 份食品進行檢測，結果見表3。SRCA和PCR方法均會出現假陽性，主要原因在于檢測過程中無法區別死菌和活菌，傳統培養方法不能檢測出死菌和不可培養狀態的菌株（viable but non-culturable，VBNC），而其DNA在SRCA和PCR方法中卻可擴增，即通過SRCA和PCR方法可以檢測到死菌及VBNC狀態的單核細胞增生李斯特氏菌。除此之外，由于SRCA方法檢測的靈敏度更高，因此出現的假陽性數量比PCR方法多。

3 結 論

本研究篩選出了一對適宜的引物，成功建立了SRCA快速檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌的方法，并通過肉眼觀察熒光判斷結果，方便簡單。利用SRCA技術對12 株單核細胞增生李斯特氏菌和40 株非單核細胞增生李斯特氏菌進行特異性檢測，其中12 株單核細胞增生李斯特氏菌顯示為陽性，其他均顯示陰性結果，證明該方法具有較好的特異性。SRCA技術檢測單核細胞增生李斯特氏菌的靈敏度為8.9×100 fg/μL，是傳統PCR方法的1 000 倍，人工污染涼拌菜樣品中的單核細胞增生李斯特氏菌檢出限為2.8×100 CFU/g，是傳統PCR方法的1/1 000，因此SRCA技術具有更高的靈敏度和更低的檢出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法對70 種實際樣品進行單核細胞增生李斯特氏菌的檢測，并以GB 4789.30—2016法為標準對SRCA方法進行評估，其敏感性為100%，特異性為97.01%，符合率為97.14%。

本研究建立的SRCA方法用于檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測切實可行，SRCA方法具有操作簡便、節省時間、成本低廉、靈敏度高、穩定性好的優勢。說明SRCA方法非常適合在中小型企業和基層檢測機構以及現場快速檢測中推廣應用。在后期的研究中，SRCA方法可與疊氮溴化丙錠[29]、疊氮溴化乙錠等結合，區分死活菌，進一步實現結果判斷的準確性。開發單核細胞增生李斯特氏菌SRCA檢測試劑盒，大力推廣該技術。