富馬酸鈉對熒光假單胞菌的抑制作用（一）

群體感應抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）指對細菌間信息交流具有阻礙作用，能干擾或抑制QS現象，且對細菌正常生命活動不造成破壞的物質。其作用機制主要有以下3 種途徑：干擾信號分子合成，如抑制信號分子合成酶活性或消除底物等合成過程；降解信號分子，使之無法達到發揮調控作用的閾值濃度；產生信號分子類似物與受體蛋白競爭性結合。因此，利用QSI干擾細菌QS系統、降低腐敗菌致腐能力成為新的研究方向。研究發現阿魏精油作為一種新型的QSI可顯著抑制紫色桿菌的QS現象。Chow等報道了水楊酸對熒光假單胞菌QS現象具有抑制作用，可有效降低其毒力效應。目前已從藥用植物、果蔬、海洋藻類中分離出具有抑制QS的天然活性物質，但其提取率低且操作繁瑣，未得到廣泛應用。而從現有食品添加劑中篩選QSI，具有成本低廉、便于合成、安全性較高等優點。

富馬酸鈉又稱富馬酸一鈉，易溶于水，常作為食品添加劑用于配制酒、飲料、罐頭和果凍等產品，是一種較安全的酸味劑。一些研究表明其具有良好的抗氧化、抑菌作用。在魚、貝類罐頭中添加富馬酸鈉可有效防止其黑變；肖爾卿等發現經過富馬酸鈉與超高壓協同處理使草莓汁中H2S含量顯著減少；此外，富馬酸鈉對腌制蔬菜中的腐敗菌具有較強的抑制作用。但目前，關于富馬酸鈉的研究主要集中在其作為食品添加劑改善食品風味方面，而作為QSI的研究卻鮮有報道。

因此，本實驗以富馬酸鈉為研究對象，探究富馬酸鈉對熒光假單胞菌QS現象的抑制效果，以期拓寬富馬酸鈉的應用范圍，為新型水產品防腐保鮮劑的研發提供新思路，豐富水產品保鮮理論。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

熒光假單胞菌分離自腐敗大菱鲆，由渤海大學食品科學研究院保藏。紫色桿菌CV026（Chromobacterium violaceum CV026）為C. violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，自身不產AHLs。當存在外源AHLs時，可產生特征性紫色菌素，對?；鶄孺滈L度為C4～C8的AHLs敏感程度不同，具有卡那霉素抗性，活化時需添加20 μg/mL卡那霉素，由渤海大學食品科學研究院保藏。

富馬酸鈉 北京索萊寶生物科技有限公司；LB肉湯青島高科園海博生物技術有限公司；甲醇 天津市津東天正精細化學試劑廠；乙酸乙酯、正丁醇、醋酸異戊酯、十二烷基硫酸鈉 天津永晟精細化工有限公司；結晶紫 天津致遠化學試劑有限公司；卡那霉素、6 種AHLs信號分子標準品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Biofuge Stratos臺式高速離心機 美國Thermo Fisher公司；MLS-3030CH立式壓力滅菌鍋廣州三洋電機有限公司；MS105UD電子分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；imark酶標儀美國Bio-Rad公司；80i顯微鏡 日本尼康公司；7890N/5975氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 富馬酸鈉的最小抑菌濃度測定及QS抑制活性的初篩

參考Diao Wenrui等的方法，將報告菌株CV026和熒光假單胞菌過夜培養至對數期（106 CFU/mL），按體積比1∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min振蕩培養至OD595 nm為1左右，用牛津杯打孔，加入不同質量濃度梯度（1.0～10.0 mg/mL）的富馬酸鈉，以無菌去離子水為空白對照，28 ℃靜置培養24～48 h后，觀察菌株生長情況。

報告菌株CV026過夜活化后，按體積比1∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min振蕩培養至OD595 nm為1左右，與100 mL含有20 μg/mL C6-HSL信號分子的LB營養瓊脂混勻，用牛津杯打孔，加入200 μL質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL的富馬酸鈉，以無菌去離子水為空白對照，28 ℃靜置培養24～48 h，觀察紫色菌素的產生情況。

1.3.2 富馬酸鈉對紫色菌素產生及紫色桿菌生長的影響

參照Kato等方法并稍作修改，將過夜活化后的報告菌株CV026按體積比1∶100接種于LB肉湯中，加入終質量濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL的富馬酸鈉，并添加20 μg/mL的C6-HSL信號分子，28 ℃、160 r/min振蕩培養至OD595 nm為1左右。取300 μL菌液于無菌離心管中，加入150 μL質量分數10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL加入96 孔板中，于595 nm波長處測定OD值，以無菌去離子水為空白對照。同時，為確定富馬酸鈉對CV026菌株生長能力的影響，以不加信號分子的實驗組作為對照，其余步驟同上。

1.3.3 富馬酸鈉對熒光假單胞菌生物被膜的影響

1.3.3.1 富馬酸鈉對熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響

根據Rode等方法將熒光假單胞菌過夜培養至對數期（106 CFU/mL），按體積比1∶100接種于LB肉湯中，分裝至無菌離心管，每管1 mL，加入富馬酸鈉使其終質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL，以無菌去離子水為陰性對照，以20 μg/mL C6-HSL為陽性對照，每組3 次重復，28 ℃靜置培養48 h。待菌液密度測定結束后，傾倒菌液，無菌水漂洗浮游菌3～5 次，無菌風干燥35 min，0.001 g/mL結晶紫溶液染色15 min，無菌水沖洗5～7 次，加入體積分數33%冰醋酸充分溶解，取200 μL于96 孔板中，在595 nm波長處測定OD值。按下式計算生物被膜形成率。

式中：ODcontrol為陰性對照組測得生物被膜的OD595 nm；ODQSI為抑制劑處理組的OD595 nm。

1.3.3.2 富馬酸鈉對熒光假單胞菌生物被膜形態的影響

載玻片（25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預處理：將載玻片清洗干凈，分別于無水乙醇中超聲30 min，去離子水中超聲30 min，烘干后滅菌備用。

將過夜活化后的熒光假單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中，取10 mL菌液加入無菌培養皿中，加入富馬酸鈉使其終質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL，將處理后的載玻片浸沒其中，28 ℃培養72 h。同時，以不添加富馬酸鈉為陰性對照組，添加C6-HSL信號分子為陽性對照組。取出載玻片后，無菌水漂洗3～5 次，適量甲醇固定15 min，0.02 g/mL結晶紫染色5 min，無菌水沖洗5～7 次，無菌風干燥固定，光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.4 富馬酸鈉對熒光假單胞菌群集和泳動的影響

參考Zhang Juanmei等方法制備群集與泳動培養基，將不同質量濃度的富馬酸鈉經0.22 μm濾膜過濾后，加入培養基混勻使其終質量濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL。取5 μL過夜活化的熒光假單胞菌菌懸液加入平板中央，待菌液吸收后28 ℃靜置培養48 h，以不添加富馬酸鈉為陰性對照，添加C6-HSL信號分子為陽性對照，每組3 次重復，期間觀察熒光假單胞菌的遷移情況。1.3.5 富馬酸鈉對熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

根據Ponnuswamy等的方法并稍作修改，按1.3.3節方法制備含有不同質量濃度（0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL）富馬酸鈉過夜活化后的熒光假單胞菌菌懸液，制作脫脂奶瓊脂平板，用牛津杯打孔，取200 μL菌液加入孔內，28 ℃靜置培養18～24 h，期間觀察其水解圈直徑。以不添加富馬酸鈉為陰性對照，以添加C6-HSL信號分子為陽性對照，每組3 次重復。熒光假單胞菌在生長過程中分泌胞外蛋白酶，使孔徑周圍出現明顯的水解圈，水解圈直徑的大小表示蛋白酶活性的高低。

1.3.6 GC-MS測定富馬酸鈉對熒光假單胞菌分泌AHLs的影響

將過夜活化后的熒光假單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中，加入富馬酸鈉，使其終質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，以不添加富馬酸鈉為陰性對照，添加C6-HSL信號分子為陽性對照，28 ℃、160 r/min振蕩培養48 h。將培養后的菌液10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等量含體積分數0.1%冰乙酸的乙酸乙酯，得有機相，旋轉蒸發蒸干溶劑，條件設置為溫度35 ℃、真空度0.1 MPa，加入適量甲醇溶解，將所得AHLs粗提液于-20 ℃保存備用。

以甲醇為溶劑制備含有6 種AHLs標準品的混合標準品溶液，由GC-MS檢測確定各種標準品的保留時間。參考趙愛飛等的方法設置GC-MS條件。

1.4 數據處理與分析

每組實驗均設有3 個平行，用SPSS 19.0軟件進行數據分析處理，Origin 8.5軟件進行繪圖處理。

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