橄欖不同生長階段的真菌分離和鑒定（二）

2 結果與分析

2.1 橄欖不同生長階段果實和葉片潛伏性真菌的分離結果

在橄欖果實和葉片的5 個生長階段（盛花期、幼果期、果實膨大期、果實成熟前期和果實成熟期），共分離到6 個屬的真菌，分別編號GL-1、GL-3、GL-5、GL-6、GL-7、GL-8，其中以GL-8和GL-3的分離頻率最高。在橄欖5 個不同生長階段的果實和葉片中，分離到的病原菌種類和頻率有所差異（表1和表2）。其中GL-8和GL-3在橄欖果實和葉片中的分離頻率都最高，而GL-1、GL-5、GL-6和GL-7這4 種真菌的分離頻率都比較低。據此認為，GL-8和GL-3是橄欖果實和葉片最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。

進一步比較發現，與果實成熟前期相比，成熟期橄欖果實中2 個主要真菌GL-8和GL-3的分離頻率下降（表1），而果實成熟期采收的葉片中GL-8和GL-3的分離頻率上升（表2）；此外，成熟期橄欖果實中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率上升（表1），但果實成熟期采收的葉片中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率下降（表2）。因此認為，橄欖果實和葉片的病原菌之間存在相互侵染現象；而成熟期橄欖果實的主要病原真菌侵染源，可能是該病原真菌在橄欖葉片上越夏或越冬造成的。

表1 橄欖果實不同生長階段分離的病原菌種類及其分離頻率

注：-.沒有分離到的橄欖病原真菌種類。下同。

表2 橄欖果實不同生長階段采收的葉片分離的病原菌種類及其分離頻率

2.2 2 種主要潛伏性真菌的致病性測定和形態鑒定

2.2.1 GL-8

圖2 橄欖GL-8的形態特征、致病性測定及病果癥狀

取無病蟲害、無機械損傷的橄欖果實，經表面消毒后，在橄欖果實表面接種GL-8的菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實病原菌接種處出現水漬狀病斑；接種后的第3天，橄欖果實病斑上出現稀薄的灰色絮狀菌絲；接種3 d之后，隨培養時間的延長，橄欖果實的病斑逐漸擴大，培養至第6天，橄欖果實全部腐爛，菌絲逐漸由灰色變為深灰色。而自然未接種的橄欖果實在發病前期，其果實局部變褐色、并伴有較少的白色菌絲；在橄欖果實發病后期，整個橄欖果實表面呈深灰色且部分凹陷，橄欖果實局部出現黑色斑點、并伴有灰色菌絲體。接種GL-8菌絲塊的橄欖果實病害癥狀與自然發病的橄欖果實癥狀相同（圖2A、B）；進一步觀察證實，從GL-8菌絲塊接種的橄欖果實中再次分離病原菌GL-8，在PDA培養基上培養，其菌落形態、菌絲形態及分生孢子與自然分離得到的GL-8相同。

顯微鏡下觀察發現，GL-8的分生孢子無色、無隔、紡錘形，大小為（18.0～28.5 μm）×（3.5～6.0 μm）（圖2F），分生孢子著生于子囊內（圖2D），子囊著生于子囊腔內（圖2E）。GL-8在PDA培養基上培養，最初出現白色氣生菌絲、而后逐漸變為灰色到深灰色；在PDA培養基上培養的初期，PDA平板背面的顏色為白色，培養2～3 d之后，其顏色從PDA平板背面的中心開始變為墨綠色、橄欖綠，之后著色逐漸擴展到PDA平板背面的邊緣、而且PDA平板背面的中心顏色進一步加深，直到整個菌落都成為黑色（圖2C）。根據菌落形態、菌絲和分生孢子形態特征，將GL-8初步鑒定為子囊菌門葡萄座腔菌科（Botryosphaeriacea）的小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）。

2.2.2 GL-3

取無病蟲害、無機械損傷的橄欖果實，經表面消毒后，在橄欖果實表面接種GL-3菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實病原菌接種處出現淡褐色并伴有微量菌絲；接種培養后期，橄欖果實表面凹陷、且產生大量的疏松菌絲，菌絲顏色呈白色。而自然未接種的橄欖果實發病前期，橄欖果實表面出現微量灰白色菌絲、并伴有不規則黑色斑點；在橄欖果實發病后期，整個橄欖果實被灰白色菌絲包裹，且菌絲體表面伴有黑色小粒分生孢子盤，橄欖果實表面凹陷、且伴有淡黃色暈圈。接種GL-3菌絲塊的橄欖果實病害癥狀與自然發病的橄欖果實癥狀相同；進一步觀察證實，從GL-3菌絲塊接種的橄欖果實中再次分離病原菌GL-3，將其在PDA培養基上培養，其菌落形態、菌絲形態及分生孢子與自然分離得到的GL-3相同。GL-3在PDA培養基上培養，出現白色的菌落及菌絲，并呈現花瓣式輪紋狀。顯微鏡下發現，GL-3的分生孢子有5 個細胞，呈紡錘狀，中間3 個細胞呈褐色；孢子頂端無色，有2～3 根頂部附屬絲；尾部細胞無色，有1 根中生式尾毛。根據菌落形態、菌絲及分生孢子形態特征，將GL-3初步鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。

2.3 橄欖果實主要潛伏性侵染病原菌的分子生物學鑒定

2.3.1 基因組DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法提取病原菌總DNA，以通用引物ITS-1和ITS-4對分離到的6 種病原菌核糖體基因轉錄間隔區（ribosomal gene internal transcribed spacer，rDNA-ITS）序列進行擴增，并將得到的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，6 種病原菌擴增產物都是單一條帶，無非特異擴增現象，且各菌株的rDNA-ITS序列片段大小均在600 bp左右。

2.3.2 rDNA-ITS序列同源性比對及系統發育分析

運用GenBank的序列局部相識查詢BLAST工具，在NCBI網站上的GenBank序列數據庫中，搜索與上述6 株病原真菌所測得的序列相似的rDNA-ITS序列，并進行分析比較。然后用MEGA6.0軟件的NJ法構建系統發育樹，并通過Bootstraps法進行檢驗，重復次數為1 000。

如表3，分離到的6 種病原真菌與相關屬內參比菌株的rDNA-ITS序列相似度都為99%或100%。據此認為，GL-1為擬莖點霉屬（Phomopsis）、GL-3為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）、GL-5為革菌屬（Phanerochaete）、GL-6為出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、GL-7為球座菌屬（Guignardia）、GL-8為小新殼梭孢（N.parvum）。

表3 橄欖果實病原真菌rDNA-ITS序列與相近菌株相似性比對

3 討 論

陳瑾和張紹升等從橄欖果實中分離到多種病原微生物，但未能明確導致采后橄欖果實腐爛的主導病原真菌種類、及其侵入時期。本實驗采用組織分離法，在橄欖不同生長階段的果實和葉片中，分離出橄欖潛伏病原真菌種類、并統計其分離頻率，進一步對橄欖潛伏病原真菌的致病性測定、形態學鑒定和分子生物學鑒定，明確了橄欖果實采后貯藏期腐爛敗壞、主要是由于病原真菌的采前潛伏侵染所導致，且明確了主要病原菌種類為小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。而球座菌屬（Guignardia）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）和出芽短梗霉（A.pullulans）等病原菌在橄欖不同生長階段的分離頻率都處于較低水平，這可能是由于橄欖果實中存在抗性物質、能有效抑制以上分離頻率較低的4 種病原真菌生長，或者是由于病原菌生長的競爭作用、導致以上4 種病原真菌不能有效生長繁殖。

本研究選用橄欖花器、果實作為實驗材料，對其潛伏性病原真菌進行分離、鑒定。由于病原菌的生長繁殖受外界氣候條件影響較大，且同一橄欖品種在同一地區不同年份、及不同橄欖品種中，其病原菌種類及其分離頻率存在一定的差異，具體差異有待于進一步研究。此外，本實驗尚未研究橄欖病原菌的侵染來源及其侵染過程，因此，需要進一步研究橄欖病原菌的來源及其侵染機制，將為橄欖果實采前病害的防治提供理論依據。

4 結 論

綜合以上分析，發現小新殼梭孢（N.parvum）、小孢擬盤多毛孢（P.microspora）、擬莖點霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）、球座菌屬（Guignardia）、出芽短梗霉（A.pullulans）6 種病原真菌是引起采后‘長營’橄欖腐爛的病原菌。其中小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤多毛孢（P.microspora）為‘長營’橄欖果實最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。上述結果為制定病原真菌采前侵染橄欖果實的控制策略提供科學依據，進而為控制橄欖果實采后病害發生、延長其保鮮期提供一定科學依據和生產實踐指導。

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